小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (46): 8062-8068.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.46.014

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小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响

侯春凤¹，孙闵²，李树杰¹，赵建宏¹，王吉波³

¹济宁市第一人民医院风湿免疫科，山东省济宁市 272002；²济宁医学院临床学院，山东省济宁市 272013；³青岛大学附属医院风湿免疫科，山东省青岛市 266071

出版日期:2013-11-12 发布日期:2013-11-30
通讯作者: 王吉波，博士，主任医师，青岛大学附属医院风湿免疫科，山东省青岛市 266071 Wangjibo2005@126.com
作者简介:侯春凤★，女，1976年生，山东省济宁市人，汉族，2008年青岛大学医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事类风湿关节炎发病机制的研究。 hfengle@126.com

Effect of small interfering RNA on gene expression of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis

Hou Chun-feng¹, Sun Min², Li Shu-jie¹, Zhao Jian-hong¹, Wang Ji-bo³

¹Department of Immunology and Rheumatology, Jining First People’s Hospital, Jining 272002, Shandong Province, China; ²Clinical College, Jining Medical University, Jining 272013, Shandong Province, China; ³Department of Immunology and Rheumatology, Affiliated Hospital, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China

Online:2013-11-12 Published:2013-11-30
Contact: Wang Ji-bo, M.D., Chief physician, Department of Immunology and Rheumatology, Affiliated Hospital, Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China Wangjibo2005@126.com
About author:Hou Chun-feng★, Master, Attending physician, Department of Immunology and Rheumatology, Jining First People’s Hospital, Jining 272002, Shandong Province, China hfengle@126.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：类风湿关节炎的病因尚不十分明确，但核转录因子κB在类风湿性关节炎发病中的作用，己逐渐引起风湿病学者的关注。
目的：通过RNA干扰技术阻断人类风湿关节炎滑膜细胞核转录因子κB信号通路，探索其在类风湿关节炎治疗中的应用前景。
方法：分离、消化、培养滑膜细胞备用。根据小分子干扰RNA设计原则，确定核转录因子κB的小分子干扰RNA 四条目标基因序列，合成并构建核转录因子κB小分子干扰RNA表达载体。将构建好的4条pGenesil-1/核转录因子κB小分子干扰RNA表达载体转染入生长状态良好的一代滑膜细胞，并设立空白和阴性对照组。收集转染后12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d不同时间段的细胞，并提取RNA。测定细胞内核转录因子κB mRNA相对表达水平，筛选出有效抑制核转录因子κB mRNA表达的小分子干扰RNA质粒载体。
结果与结论：核转录因子κB在人类风湿关节炎滑膜细胞高表达，3#pGenesil-1/核转录因子κB能显著抑制人类风湿关节炎滑膜细胞核转录因子κB mRNA表达。RNA干扰技术可阻断核转录因子κB mRNA的表达，因此，可将阻断核转录因子κB信号通路作为基因治疗类风湿关节炎的靶点。

关键词: 组织构建, 组织构建细胞学实验, 关节炎, 类风湿, 核转录因子κB, pGenesil-1表达载体, RNA干扰, 实时荧光定量聚合酶链反应

Abstract:

BACKGROUND: The etiological factor for rheumatoid arthritis remains unclear, but the effects of nuclear factor-κB on the onset of rheumatoid arthritis have been gradually paid great attention by rheumatologists.
OBJECTIVE: By using the RNA interference (RNAi) technique to block the signal pathway of nuclear factor-κB mRNA of human rheumatoid arthritis synovial cells, this study explored its application prospect in the treatment of rheumatoid arthritis.
METHODS: The synovial cells were isolated, digested, and cultured for further use. In accordance with the design principle of small interfering RNA (siRNA), target sequences of siRNA of nuclear factor-κB were identified, and siRNA expression vector of nuclear factor-κB was synthesized and constructed. The four pGenesil-1/nuclear factor-κB siRNA expression vectors were transfected into the first passage of synovial cells that well grew. Blank and negative control groups were set. Cells at 12, 24, 48, 72 hours, 5 and 7 days after transfection were collected, and RNA was extracted. Intracellular nuclear factor-κB mRNA expression levels were measured, and siRNA plasmid vector that could effectively inhibit nuclear factor-κB mRNA expression was screened out.
RESULTS AND CONCLUSION: Nuclear factor-κB highly expressed in synovial cells after human rheumatoid arthritis. 3#pGenesil-1/nuclear factor-κB apparently suppressed nuclear factor-κB mRNA expression in synovial cells with human rheumatoid arthritis. RNAi technique blocked nuclear factor-κB mRNA expression. Therefore, the block of nuclear factor-κB signal pathway might be a good target for rheumatoid arthritis gene therapy.

Key words: arthritis, osteoarthritis, arthritis, rheumatoid, rheumatoid factor, rheumatoid nodule, nuclear factor-kappa B, synovial membrane

中图分类号:

R318

侯春凤，孙闵，李树杰，赵建宏，王吉波. 小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(46): 8062-8068.

Hou Chun-feng, Sun Min, Li Shu-jie, Zhao Jian-hong, Wang Ji-bo. Effect of small interfering RNA on gene expression of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(46): 8062-8068.

图/表（结果） 3

2.1 培养的一代滑膜细胞形态 传代前的一代滑膜细胞，在光镜下见细胞呈三角形、梭形，细胞核成卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，见图2，3。

2.2 免疫组织化学观察 细胞免疫组织化学染色反应示细胞抗Vimentin染色阳性，胞浆内见大量棕黄色颗粒，衬染的核呈蓝色，见图4。

2.3 质粒pGenesil-1/核转录因子κB转染人滑膜细胞结果 人滑膜细胞转染后应用倒置荧光显微镜检测到发绿色荧光的细胞，见图5，6。

细胞转染pGenesil-1质粒后24 h荧光显微镜下观察荧光细胞与自然光下细胞数之比即质粒转染效率估计约60%。

2.4 荧光定量PCR检测转染后细胞核转录因子κB mRNA含量见表1。

各观察组间核转录因子κB mRNA的表达量差异有显著性意义(F=14.770，P=0.000 4< 0.001)。pGenesil-1/ HK组、1#pGenesil-1/核转录因子κB组、2#pGenesil-1/核转录因子κB、4#pGenesil-1/核转录因子κB组与空质粒对照组间差异无显著性意义(P > 0.05)，且任意两组间比较，差异也无显著性意义，提示pGenesil-1/HK组、1#pGenesil-1/核转录因子κB、2# pGenesil-1/核转录因子κB和4#pGenesil-1/核转录因子κB对核转录因子κBmRNA的水平无影响。转染后 12 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d六个不同的时间段，3#pGenesil-1/核转录因子κB组与空质粒对照组(P=0.000 1)、1#pGenesil-1/核转录因子κB组 (P=0.000 4)、2#pGenesil-1/核转录因子κB(P=0.000 6)、4#pGenesil-1/核转录因子κB组(P=0.000 1)、pGenesil-1/HK组比较(P=0.000 8)，差异均有显著性意义(P < 0.01)。3#pGenesil-1/核转录因子κB组滑膜细胞表达核转录因子κBmRNA水平明显低于其他pGenesil-1/核转录因子κB重组真核表达载体组，也低于阴性对照组，其抑制率为70%。由此确立了3# pGenesil-1/核转录因子κB可以成功转染人滑膜细胞并有效阻抑核转录因子κB mRNA的合成。

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引言

材料方法

设计：体外实验，对照观察。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年2月在济宁市第一人民医院中心实验室完成。

材料：

滑膜组织：取自行膝关节滑膜切除的类风湿关节炎患者(济宁市第一人民医院骨科)，均为临床手术切除，用于实验患者均知情同意，实验符合医学伦理学标准。

实验方法：

人类风湿关节炎滑膜细胞的培养：无菌条件下，剔除滑膜周边的脂肪组织，用无钙、镁离子的PBS洗涤滑膜组织3次，剪成1.0-2.0 mm³小块，放入25 cm²瓶内，同时加入体积分数10%胎牛血清-DMEM培养液2 mL和0.8%胶原酶2 mL，使胶原酶终浓度为0.4%，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中消化2 h；将未贴壁细胞移入离心管，离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清液；加入0.25%胰蛋白酶4 mL，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中消化 30 min；200目尼龙网过滤，离心(1 000 r/min，10 min)，弃上清液；用4 mL、体积分数10%胎牛血清-DMEM培养液重悬细胞，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养24 h，换液，弃去未贴壁细胞，此时的贴壁细胞为原代滑膜细胞；培养至80%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，细胞传代培养。

细胞免疫化学染色观察：将细胞悬液加入24孔板孔内(孔内预先置d=10 mm 圆玻片)，培养箱中培养12 h，弃上清，甲醇-20 ℃固定15 min。洗涤圆玻片，待干燥后用于免疫组织化学。滴加Ⅰ抗鼠抗人Vimentin单克隆抗体及鼠抗人CD68单克隆抗体(对照)。37 ℃孵育1 h，PBS洗涤圆玻片；羊血清封闭20 min后，PBS洗涤圆玻片；滴加兔抗鼠的Ⅱ抗(碱性磷酸酶标记) 37.0 ℃孵育 1 h，PBS漂洗圆玻片。滴加DAB，H₂O₂显色5 min。PBS洗涤圆玻片。苏木精复染，体积分数1%盐酸乙醇分化乙醇梯度脱水，二甲苯透明后封固。显微镜下观察细胞形态。

pGenesil-1/核转录因子κB小分子干扰RNA的设计、合成：首先在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中寻找人核转录因子κB的mRNA序列全长，然后根据文献报道和Elbashir等提出的目标序列的选取原则^[5]，利用网上设计工具进行目标序列的筛选，使用BLAST将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列，确定人核转录因子κB的小分子干扰RNA目标基因序列：1# GAT CAA TCG CTA CAC AGGA、#2 GTT CCT ATA GAA GAG CAGC、3# GGA CAT ATG AGA CCT TCAA、4# GAG CAT CAT GAA GAA GAGT，设立阴性对照小分子干扰RNA，同样进行BLAST比对检查以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。阴性小分子干扰RNA序列为GAC TTC ATA AGG CGC ATGC。以上小分子干扰RNA合成和载体构建由武汉市晶赛生物工程技术有限公司完成，质粒构建模式见图1。

重组质粒pGenesil-1/核转录因子κB转染人滑膜细胞：取生长良好的第1代人滑膜细胞进行转染观察。转染前 1 d，24孔板每孔接种含细胞数约为 6×10⁴的体积分数10%胎牛血清-DMEM培养液700 μL；培养板孔底部面积的60%-80%被待转染细胞覆盖时，利用Effectene Transfection Reagent转染试剂进行转染。并设空质粒对照组、阴性质粒对照组、1#质粒转染组、2#质粒转染组、3#质粒转染组和4#质粒转染组6组。

应用绿色荧光蛋白检测评价转染效率：转染后48 h用倒置相差显微镜，先后在自然光和紫外激发光源条件下观察人滑膜细胞。两人同时独立估计相同视野下绿色荧光细胞数与自然光下总细胞数百分比，取其平均值作为转染效率。

FQ-PCR 测定细胞内核转录因子κB mRNA水平：分别于转染后12 h、24 h、48 h、27 h、5 d、7 d收集各组的滑膜细胞，用Trizol常规提取总RNA。设计合成引物、探针。

核转录因子κB的上游引物： 5’- CCC CAC GAG CTT GTA GGA AAG-3’ ，下游引物： 5’- TAG TCC CCA CGC TGC TCT TCT-3’，探针：5’(FAM)-ACT GCC GGG ATG GCT TCT ATG AGG C- (TAMRA)-3’；内参3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物：5’-CTT AGC ACC CCT GGC CAA G-3’，下游引物：5’-GAT GTT CTG GAG AGC CCC G-3’，探针：5’(FAM)-CAT GCC ATC ACT GCC ACC C AG AAG A(TAMRA)-3’。FQ-PCR测定核转录因子κB基因干扰效果。

反应条件为：95 ℃ 10 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 45 s，共40个循环，反应体系为20 µL。

相对表达量计算：读取Ct，首先计算各样本待测基因Ct值与管家基因(GAPDH) Ct值的差值，即△=Ct₍_目的基因₎-Ct_(GAPDH)，再将各实验组样本的△Ct 减去正常对照(空白组)的△Ct，即得△△Ct；最后利用2^-^△△Ct进行计算，使用该方法可以直接得到待测基因相对于管家基因的定量。

主要观察指标： ①观察培养的滑膜细胞形态并行细胞鉴定。②观察转染效果计算转染效率。③应用FQ-PCR 测定不同时间段不同组别细胞内核转录因子κBmRNA水平。

统计学分析：第一作者应用SPSS 13.0统计软件包进行数据的统计学处理。应用重复测量设计资料的方差分析，进行各观察组之间和不同时间段各组间的比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

类风湿关节炎以滑膜炎为主要特征，滑膜组织内有大量炎症细胞浸润，滑膜细胞过度释放肿瘤坏死因子、白细胞介素1和白细胞介素6等多种炎性细胞因子，炎症因子对类风湿关节炎的发生和发展都有重要的作用，是病变加重的主要原因^[7-10] 。促炎细胞因子在类风湿关节炎的滑膜炎症和关节破坏中的重要作用已得到越来越多的关注^[11-12] 。
近年来研究发现，在类风湿性关节炎滑膜组织中核转录因子κB异常活化^[13] ，核转录因子κB 通路在类风湿关节炎的炎症进程中有重要地位。类风湿关节炎发病中众多细胞因子和细胞黏附分子被激活受到核转录因子κB的转录调控^[14-16] 。同时，类风湿关节炎滑膜表达的许多炎症递质又可作用于核转录因子κB 使其活化，如肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β^[17-20] ，通过正反馈环路导致炎性过程放大与持续^[21] ，导致类风湿关节炎炎症反应和结构破坏得以维持与发展。核转录因子κB静息状态下呈无活性状态存在于胞质中，胞外多种刺激可以激活核转录因子κB，使之进入核内和相应 DNA 启动子序列结合，调控众多与炎症反应、免疫、细胞凋亡、组织增生有关的基因转录^[22-29] 。作者前期通过检索分析了核转录因子κB与类风湿关节炎发病机制及治疗影响，核转录因子κB是一组重要的转录调节因子，参与调节许多与免疫功能和炎症有关的基因，许多基因的启动子中都有功能性核转录因子κB的结合位点。核转录因子κB异常活化在类风湿关节炎发病机制中占据重要地位。针对核转录因子信号通路的各个环节抑制其活化的研究，是近年来抗炎、抗风湿治疗的热点^[30] 。
国内外众多学者提出核转录因子κB是极具潜力的新型抗炎靶点，并把它作为抗炎研究的热点，目前已报道了包括肾上腺皮质激素、抗氧化剂蛋白激酶抑制剂在内的多种核转录因子κB抑制剂，但由于对细胞的其他正常功能产生影响从而带来一定的毒副作用，其临床应用受到限制^[31] 。随着基因治疗的发展，近年来人们开始考虑基因治疗类风湿关节炎^[32-35] 。RNA干扰技术是一种特异性的转录后基因沉默现象，具有特异性、高效性及稳定性等特点，被广泛应用于基因敲除、基因治疗等领域[^36-37] 。RNA干扰技术作为一种基因治疗手段得到了广泛深入的研究^[38-41] 。Raymond 等通过电穿孔的方法向关节滑膜细胞中导入靶向肿瘤坏死因子α小分子干扰RNA，观察到胶原诱导型关节炎小鼠关节炎症反应缓解，初步证实了RNA干扰靶向细胞因子肿瘤坏死因子α治疗类风湿关节炎的可能性。Maroun 等将脂质体及小分子干扰RNA片段共同静脉注射入胶原诱导型关节炎小鼠体内，观察到了治疗效果。
目前，国内尚没有通过RNA干扰核转录因子κB表达治疗类风湿关节炎的研究文献。陈巧林等^[42]认为人类白细胞抗原(HLA)-DR分子、抗原肽及T细胞受体(TCR)三者之间的相互识别以及三分子复合物的形成是类风湿关节炎发病的始动环节。人类白细胞抗原(HLA)-DRβ1*0401小分子干扰RNA双链体(siRNAs)和人类白细胞抗原-DRβ1*0405 siRNAs，通过Priess细胞RNAi实验筛选确定最佳HLA-DRβ1*0401 siRNA目标序列，最终通过干扰类风湿关节炎患者外周血单个核细胞，探索类风湿关节炎的发病机制及治疗途径。姜林娣等[43]设计构建了针对人COX-2的小分子干扰RNA，在蛋白水平及基因水平均观察到hCOX-2表达下降，并同时观察到hCOX-2下游产物前列腺素2表达下降。
本实验中应用同样原理来干扰核转录因子κB的基因表达进而下调核转录因子κB的蛋白水平。实验根据网上的小分子干扰RNA设计工具并参考相关文献，构建了表达核转录因子κB 小分子干扰RNA的4条载体及作为对照的无效小分子干扰RNA。以阳离子脂质体Effectene Transfection Reagent为转染试剂，成功地实现了核转录因子κB小分子干扰RNA的转染。实验结果示3#重组真核载体抑制率为70%,与相关文献报道相比较，本实验的核转录因子κB mRNA敲除率稍低。然而文献报道，DNA载体细胞内表达小分子干扰RNA技术对靶基因的敲除率与化学合成的小分子干扰RNA相似，且可在细胞内较长期稳定表达小分子干扰RNA，RNA干扰效果更为确切、持久[^44-45] 。因此考虑本实验核转录因子κB最高抑制率低于国外文献报道，可能与pGenesil-1质粒转染滑膜细胞的效率较低有关，如果能进一步提高转染效率并降低转染混合物的毒性作用，利用RNA干扰技术在转录后水平实现对核转录因子κB mRNA的降解从而实现对核转录因子κB 蛋白表达的调控，将为抑制滑膜细胞激活进而对抗由于滑膜细胞激活所导致的滑膜炎提供更加有效、可靠的手段。
综上所述，质粒载体携带小分子干扰RNA基因转染可抑制体外人类风湿关节炎滑膜组织核转录因子κB mRNA的表达，具有一定的实验效应，为评价抑制后核转录因子κB的生物学功能和核转录因子κB小分子干扰RNA治疗的潜在价值，以及构建病毒载体进行体内实验奠定基础。但是基础核转录因子κB活性是机体正常发育所必须的，p65基因敲除的小鼠由于发生肝细胞大量凋亡而死于胚胎期。所以如何局部、靶向转染，抑制病变部位或细胞内核转录因子κB而不发生全身免疫抑制尚需更进一步研究。

小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响

Effect of small interfering RNA on gene expression of synovial cells in patients with rheumatoid arthritis

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